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  A Tecnologia do DNA
04/05/2011

DIOGO BARTH PACINI
DF - BRASILIA
Resumo sobre a tecnologia utilizada no DNA

Área(s) de Atuação que o Presente Artigo trata
Biologia
Saúde
Treinamento e Ensino na Área de Saúde
Biotecnologia e Produção
Biologia Molecular


PACINI, Diogo Barth.

EXTRAÇÃO DO DNA A extração de DNA de células eucariontes consta fundamentalmente de três etapas: a) ruptura das células para liberação dos núcleos; b) desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos, DNA e proteínas; c) separação do DNA dos demais componentes celulares AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIÇÃO As enzimas de restrição são endonucleases que clivam o DNA em regiões específicas. Existem 3 tipos de enzimas de restrição: Tipo I = corta o DNA aleatoriamente a 1000 pb do sítio de especificidade; Tipo II = cortam no sítio de especificidade ou perto dele; Tipo III = cortam a 24 – 26 pb 3’ do sítio de especificidade. As enzimas tipo II são as mais usadas em engenharia genética pelo fato de que seu padrão de clivagem é previsível e controlado. Eles geralmente cortam regiões específicas dentro de tetra, penta ou hexanucleotídios que tem um duplo eixo de simetria rotacional. Tais seqüências são denominadas de palíndromos A ELETROFORESE DO DNA A eletroforese em gel de agarose permite estimar a concentração de uma solução contendo fragmentos de ácidos nucléicos mas, sobretudo, permite separar e purificar estes fragmentos. As amostras são aplicadas no gel e separadas sob ação de um campo elétrico, sendo que os fragmentos de menor massa molecular migram mais rapidamente que os fragmentos de maior massa molecular. Após a migração ou corrida, os fragmentos são visualizados por coloração com brometo de etídio, agente intercalante que fluoresce após excitação com luz ultravioleta (UV). O limite de detecção é de cerca de 10 ng/banda de ácido nucléico. A distância de migração dos fragmentos analisados é inversamente proporcional ao log10 de seu tamanho. Com auxílio de marcadores de massa molecular conhecidos, é possível determinar o tamanho de um fragmento. A migração dos fragmentos de ácidos nucléicos em um gel de agarose é função de seu tamanho, da concentração do gel e da voltagem aplicada. Nas condições de corrida utilizadas, os ácidos nucléicos são carregados negativamente, migrando do pólo negativo para o positivo. HIBRIDIZAÇÃO E SONDAS GÊNICAS A hibridação de ácidos nucléicos, permite o reconhecimento entre seqüências complementares de DNA ou RNA. Assim, um determinado fragmento de DNA pode ser localizado em uma mistura heterogenia, desde que se disponha de uma seqüência complementar ao fragmento. Essa seqüência complementar é chamada de sonda e consiste em seqüência de nucleotídeos de DNA ou de RNA que forma clonadas ou sintetizadas in vitro, utilizando-se nucleotídeos marcados com isótopos radioativos. Quando o DNA é submetido a temperaturas de 90 a 100ºC, os dois filamentos de polinucleotídeos desnaturam, ou seja, eles se separam. Se esses filamentos desnaturados são incubados em condições apropriadas de temperatura (em torno de 65ºC), eles renaturam, ou seja, as bases complementares paream, formando-se novamente o duplo filamento. Dessa maneira, formam-se híbridos, entre seqüências complementares de ácidos nucléicos. Se a sonda radioativa estiver presente no meio de incubação, ocorrerá o pareamento entre a sonda e o fragmento complementar a ela. Esses híbridos podem ser formados entre dois filamentos de DNA, dois filamentos de RNA ou um filamento de DNA com um de RNA A TÉCNICA DE SOUTHERN E NORTHERN Para detectar quais das muitas moléculas de DNA ou RNA em um gel de agarose se hibridizam a uma sonda em particular , são feitas transferências de Southern (para DNA) ou Northern (para RNA). As moléculas de ácido nucléico são separadas por eletroforese em gel de agarose e estas transferidas para uma membrana de náilon ou nitrocelulose. Isto geralmente é feito por ação capilar, mais pode ser obtido por eletrotransferência, transferência a vácuo ou centrifugação. Na transferência de Southern, antes de ser feita a transferência, o DNA é geralmente desnaturado com álcali, de modo que é unifilamentar e esta pronto para hibridização, Para o RNA, isso não é necessário e iria hidrolisar as moléculas. Uma vez feita a transferência, os procedimentos de Southern e Northern são idênticos. As transferências Northern dão informações sobre o tamanho do mRNA e quaisquer precursores, e podem ser úteis para determinar se um clone de cDNA usado como sonda tem tamanho total ou se ele é de uma família de transcritos correlatos. As transferências Southern de fragmento de DNA genômico clonado pode ser sondadas com moléculas de cDNA para encontrar quais partes do clone genômico correspondem ao fragmento de cDNA. Se a transferência de Southern contem fragmentos de DNA genômico de todo o genoma, a sonda dara informações sobre o tamanho do fragmento onde está o gene no genoma, e quantas cópias de gene estão presentes no genoma. O FINGERPRINT Se as transferências de Southern do DNA genômico digerido por enzimas de restrição de membros de uma família são hibridizados com uma sonda que detecta um destes tipos de repetição, cada amostra apresentará um conjunto de bandas de tamanhos variados. Algumas destas bandas são comuns às da mãe, e algumas às do pai, e o padrão de bandas será diferente de uma pessoa não aparentada. Os padrões diferentes de indivíduos em cada um destes tipos simples de repetição significa que, usando um pequeno numero de sondas, a possibilidade de dois indivíduos terem o mesmo padrão torna-se extremamente pequena. Esta é a técnica de fingerprinting de DNA, que é usada na ciências forense para eliminar o inocente e condenar os criminosos. Também é aplicada para testes de maternidade e paternidade em humanos. Também pode ser usada para mostrar heredograma em animais cruzados comercialmente, e para descobrir hábitos reprodutivos em animais selvagens. O Fingerprint pode ser feito com pequenas amostras de DNA tais como mancha de sangue ou folículo de cabelo em uma cena de crime. A SÍNTESE DE DNA SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS A síntese de oligonucleotideos tanto de DNA e RNA são feitos por equipamentos automatizados. Os oligonucleotídeos são sintetizados utilizando-se um sintetizador de DNA, que é basicamente um sistema computadorizado de liberação de reagentes. A síntese de DNA é um processo cíclico que reúne uma cadeia de nucleotídeos da extremidade 3' para 5'. A primeira base é acoplada em um suporte sólido e monômeros de nucleotídeos são adicionados um a um, através de um ciclo de 4 reações químicas. A síntese de oligonucleotideos e oligopeptideos tornou-se uma tarefa laboratorial altamente simplificada. O DNA pode ser sintetizado sob a forma de fita simples, tanto de pequeno tamanho, quanto de tamanho maior. Usando as fitas de pequeno tamanho pode introduzir-se mutações em genes. As fitas de DNA de grande tamanho (200pb) usam-se tanto como sondas, como para construir genes sintéticos (primers) que têm a enorme vantagem de possuir sítios de clivagem para as endonucleases de restrição, que não se encontram nos genes naturais, o que torna a manipulação daqueles muito mais facilitada. SINTESE DE cDNA A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vírus de RNA de tumor, tornou possível a síntese in vitro de DNA usando-se como molde mRNA. O DNA produto dessa reação é o DNA complementar ou cópia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A síntese e possível clonagem de cDNAs contribuiram para grandes avanços na análise da estrutura e expressão de genes de eucariotos e propiciaram uma revolução tecnológica nas indústrias farmacêutica e de alimentos. Esses clones são comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construídas a partir da população de mRNA isolada da célula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparação com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas são enriquecidas com seqüências gênicas. Uma vez que o cDNA é cópia da mensagem, ele não contém introns e apresenta significativamente poucas seqüências que não codificam para proteínas. A ausência de introns permite que cDNAs relativos a células de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactérias e em outros microorganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídeos importantes tanto na área de pesquisa como na área aplicada. A ausência de introns também facilita a determinação direta da seqüência da mensagem e subsequente dedução da seqüência de aminoácidos da proteína por ela codificada. Isso tem resultado na identificação da seqüência de uma enorme quantidade de proteínas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas genética ou bioquimicamente. A REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) É uma técnica capaz de obter grandes quantidades de fragmentos individuais de DNA in vitro, isso é possível graças a utilização da DNA-polimerase que são extraídas da bactérias Thermus aquaticus, que vive em fontes de água quentes, e, por isso, foi denomidada Taq-polimerase. Essas enzimas são utilizadas para adicionar ao desoxirribonucleotídeos a um pequeno segmento de DNA, ou primer, que dirige a síntese do novo segmento de DNA sobre o molde onde o primer se ligar. A PCR pode ser dividida em três etapas fundamentais. (1) A mistura da amostra de DNA + Taq-polimerase + primers + os quatros nucleotídeos que compõem a molécula de DNA (dCTP, dATP, dGTP e dTTP) é submetida a uma temperatura de 92-94ºC, para que ocorra a separação dos dois filamentos de DNA. (2) Abaixamento da temperatura para que o primers se liguem às extremidades 3’ de cada filamento de DNA, que têm as seqüências de nucleotídeos complementares. A Taq-polimerase vai adicionando nucleotídeos às extremidades 3’ dos primers, copiando os filamentos de DNA e formando filamentos complementares a cada um deles. (3) A temperatura é novamente elevada, fazendo com que os novos filamentos de DNA se separem dos antigos, que foram usados como molde. Ao final, o processo volta a repetir várias vezes. Em cada ciclo, o número de genes (segmento de DNA) é duplicado, e, como cada ciclo dura 2-3 horas, em algumas horas o DNA podes ser copiado bilhões de vezes. Além de rápida, a PCR é uma técnica tão sensível que pode amplificar o DNA de uma única célula. O SEQÜENCIAMENTO DO DNA O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa”. OS ARRAYS Microarranjo, é uma técnica experimental da Biologia Molecular que busca medir os níveis de expressão de transcritos em larga escala, ou seja, medindo muitos (em alguns casos todos os) transcritos simultaneamente. O termo microarranjo é uma tradução natural e aceita para o termo em inglês microarray pelo qual esta técnica é mais conhecida. Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma superfície sólida, usualmente lâminas de microscópio revestidas com compostos que conferem carga positiva. Os microarrays também podem ser preparados em membranas de nylon positivamente carregadas. Os microarrays são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucleicos (mRNA na forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de amostras biológicas, as quais são postas para hibridar com o DNA fixado no array (hibridação por complementariedade de bases). A detecção é possível pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5) quando utiliza-se microarrays em vidro ou com o isótopo 33-P quando os arrays são preparados em membranas de nylon. Para a preparação dos microarrays, utilizam-se robôs altamente precisos que aplicam as diferentes amostras de DNA em diminutos pontos (spots) no centro de uma lâmina de microscópio com a superfície quimicamente preparada (densidade aproximada de 10.000 pontos/cm2). Nota-se que cada ponto representará um segmento gênico em particular. Quanto mais pontos no microarray, mais abrangente ele será na análise do trancriptoma. Também são preparados oligo-microarrays pela tecnologia de síntese in-situ (mais apropriadamente referidos como DNA-chips). Neste caso, os oligonucleotídeos são sintetizados na própria lâmina numa densidade de 30-50.000 pontos/cm2. A tecnologia dos microarrays tem impulsionado de maneira importante a pesquisa de genômica funcional dos diferentes organismos, desde bactérias até o homem, incluindo situações normais e patológicas (câncer, doenças autoimunes, doenças degenerativas entre outras). GLOSSÁRIO Adenilato Ciclase – Enzima ligada à membrana celular que catalisa a síntese de AMP (adenosina monofostato) cíclico ou cAMP, a partir de ATP. O cAMP é um componente importante de diversas vias intracelulares transmissoras de sinais recebidos pela célula. AMP cíclico – Adenosina monofosfato cíclica, uma molécula importante na transmissão intracelular de sinais. Anticódon – Os três nucleotídeos, na molécula do RNA de transferência, que reconhecem o códon do RNA mensageiro. A complementaridade entre o anticódon e o códon serve para inserir, na molécula protéica, o aminoácido transportado pelo RNA de Transferência. ATPase – Enzima muito abundante nas células, que rompe a ligação química do grupo fosfato terminal do ATP, liberando energia e gerando ADP e fosfato inorgânico. ATPsintetase – Complexo enzimático encontrado na membrana interna das mitocôndrias, na membrana dos cloroplastos e na membrana plasmática das bactérias. Catalisa a síntese de ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico. cDNA – O mesmo que DNA complementar; molécula de DNA sintetizada como uma cópia de um RNA mensageiro, que é constituída somente por éxons, sem íntrons. Usado para determinar na seqüência de aminoácidos numa proteína, pela determinação da seqüência de nucleotídeos no cDNA ou para produzir grandes quantidades de proteína. Cinases – Enzimas que transferem um grupo fosfato de um nucleosídeo trifosfato, como ATP, para outra molécula. Códon – Seqüência de três nucleotídeos, na molécula do RNA mensageiro, que representa a instrução para a incorporação de um determinado aminoácido no polipeptídeo em formação. Códon de iniciação – é o códom AUG, onde ribossomos se prende ao RNA mensageiro, assegurando a leitura correta do mRNA, e a síntese do polipeptideo com a seqüência correta de aminoácidos. Códon de terminação – seqüência de três nucleotídeos, na molécula de RNA mensageiro, que significa a instrução para o término da síntese do polipeptideo. Há mais de um códon de terminação. DNA recombinante – molécula de DNA contendo seqüências nucleotídicas provenientes de mais de uma fonte. DNA-polimerase – Enzimas que participam da síntese de novos filamentos de DNA, copiando os filamentos antigos. DNA-satélite – DNA altamente repetitivo (muitos nucleotideos iguais) que se concentra na heterocomatina constitutiva (não confundir com satélite do cromossomo). Endonuclease de restrição – Também conhecida como enzima de restrição. Engenharia genética - conjunto de técnicas e métodos que permitem a manipulação do material genético. Enzimas de Restrição - enzimas que cortam o material genético em lugares definidos. Estampagem (imprinting) – sistema de marcas químicas agregadas ao cromossomos que servem de indicação sobre quais genes podem ou devem ser transcritos. Éxons – as partes da moléculas de um pré-RNA mensageiro (ou seu equivalente no DNA) que vão codificar uma cadeia polipeptídica após remoção dos íntrons. Helicase – enzima que separa as duas cadeias do filamento duplo de DNA, consumindo energia do ATP para romper as pontes de hidrogênio entre as bases. Essencial para a replicação do DNA e para a síntese de RNA na transcrição. Hibridização in situ – técnica para a localização de gene (DNA) ou de RNA mensageiro. O ácido nucléico em estudo é conservado no seu local celular, e sobre ele se faz reagir moléculas conhecidas e marcadas de DNA ou de RNA (sondas ou probes). A identificação da molécula marcada indica a localização do gene ou do mRNA procurado. Íntrons – as partes da molécula de um pré-RNA mensageiro, ou seu equivalente no DNA, que são removidas por “splicing”, para possibilitar a junção dos éxons que irão constituir a molécula de RNA mensageiro. Ligase - enzima usada para a ligação de moléculas de ácidos nucléicos. RNA heterogêneo – também designados de hnRNAs, é um grupo complexo de moléculas de RNA intracelulares, algumas muito grandes, e incluindo os pré-RNAs. Este últimos, depois de processos por splicing dão origem aos RNAs mensageiros. RNA mensageiro – ou mRNA, é a molécula intermediária entre um gene e o polipeptídeo codificado por ele. A molécula do RNA mensageiro é sintetizada sobre um filamento de DNA e contém a informação para codificar um determinado polipeptídeo. RNA polimerase I – a enzima de transcrição encontrada nas células que sintetiza os RNAs ribossômicos. RNA polimerase II – a enzima de transcrição encontrada nas células eucariontes, que sintetiza os RNAs mensageiros, e a maioria dos RNAs de moléculas pequenas. RNA polimerase III – a enzima de transcrição encontrada nas células eucariontes, que sintetiza os RNAs de tranferência e o RNA dos ribossomos. SnRNA – as letras sn vêm do inglês SMALL NUCLEAR. Pequenas moléculas de RNA encontradas exclusivamente no núcleo celular, que fazem parte do spliceosomes e participam da remoção dos íntrons das moléculas de RNA mensageiro. Tecnologia do DNA Recombinante - a totalidade de métodos que, através de técnicas de biologia molecular, permitem a manipulação do material genético. Transcriptase – Enzima que participa da fabricação de moléculas de RNA copiando um modelo de DNA no processo denominado transcrição. Transcriptase reversa – também chamada de transcriptase inversa; enzima que sintetiza DNA copiando uma molécula de RNA; importante para a multiplicação dos víruas com genoma de RNA (retrovirus). BIBLIOGRAFIA CONSULTADA JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, José – Biologia celular e molecular. 7ª ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1998. LEITE, Marcelo – Folha Explica: O DNA. São Paulo, Publifolha, 2003. MALAJOVICH, Maria Antonia – BIOtecnologia. Rio de Janeiro, Axcel Books do Brasil Editora, 2004. TURNER, P. C.; MCLENNAN, A. G.; BATES, A. D.; WHITE, M. R. H. - Biologia Molecula. 2ª ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2004. DNAi. WATSON, James D.. DNA – O segredo da vida: 4ª ed., Companhia de letras, 2008. Wikipédia Para ver o artigo completo entre no site: http://diogobiotech.blogspot.com/2010/03/tecnologia-do-dna.html


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